Junto a éste, Leonardo se inició en diversas actividades, desde la pintura de retablos y tablas hasta la elaboración de grandes proyectos escultóricos en mármol y bronce. En 1472 entró a formar parte del gremio de pintores de Florencia y en 1476 todavía se le menciona como ayudante de Verrocchio, en cuya obra Bautismo de Cristo (c. 1470, Galería de los Uffizi, Florencia), pintó el ángel arrodillado de la izquierda y el paisaje de matices neblinosos.

En 1478 Leonardo alcanzó la maestría. Su primer encargo, un retablo para la capilla del palazzo Vecchio, sede del ayuntamiento florentino, no llegó a ejecutarse. Su primera gran obra, Adoración de los Magos (Uffizi), que dejó inacabada, se la encargaron los monjes de San Donato de Scopeto, cerca de Florencia, hacia 1481. Otras obras de su etapa juvenil son la denominada Madonna Benois (c. 1478, Museo del Ermitage, San Petersburgo), el retrato de Ginebra de Benci (c. 1474, National Gallery, Washington) y el inacabado San Jerónimo (c. 1481, Pinacoteca Vaticana).

En 1482 Leonardo entró al servicio de Ludovico Sforza el Moro, duque de Milán, tras haberle escrito una carta en la que el artista se ofrecía como pintor, escultor, arquitecto, además de ingeniero, inventor e hidráulico y donde afirmaba que podía construir puentes portátiles, que conocía las técnicas para realizar cañones, que podía hacer barcos así como vehículos acorazados, catapultas y otras máquinas de guerra y que incluso podía realizar esculturas en mármol, bronce y terracota. De hecho, sirvió al duque como ingeniero en sus numerosas empresas militares y también como arquitecto. Además, ayudó al matemático italiano Luca Pacioli en su célebre obra De Divina Proportione (1509), que trata sobre el sistema de relaciones armónicas conocido como sección áurea.

Existen evidencias de que Leonardo tenía discípulos en Milán, para los cuales probablemente escribió los textos que más tarde se agruparían y publicarían en París después de la muerte del artista bajo el título Tratado de la pintura (1651). La obra más importante del periodo milanés son las dos versiones de la Virgen de las rocas (1483-1485, Louvre, París, y 1505, National Gallery, Londres), donde aplica un esquema compositivo triangular que encierra a la Virgen, el Niño, san Juan y el ángel, y por otro lado, utiliza por primera vez la técnica del sfumato. De 1495 a 1497 trabajó en su obra maestra La última cena, pintura mural para el refectorio del monasterio de Santa Maria delle Grazie, Milán. Desgraciadamente, el empleo de una técnica experimental de pintura al óleo sobre yeso seco provocó problemas técnicos que condujeron a su rápido deterioro hacia el año 1500. Desde 1726 se llevó a cabo un largo proceso de restauración y conservación que culminó en 1999. Una vez completado el proceso, no exento de cierta polémica, han reaparecido muchos detalles ocultos durante años. También se ha puesto de relieve el brillante colorido de la obra original, que había quedado ensombrecido por las restauraciones anteriores. Aunque la mayor parte de la superficie original se ha perdido, la grandiosidad de la composición y la penetración fisonómica y psicológica de los personajes dan una visión aproximada de su pasado esplendor.

Durante su larga estancia en Milán, Leonardo también realizó otras pinturas y dibujos (la mayoría de los cuales no se conservan), escenografías teatrales, dibujos arquitectónicos y maquetas para la cúpula de la catedral de Milán. Su mayor encargo fue el monumento ecuestre en bronce a tamaño colosal de Francesco Sforza, padre de Ludovico, para su ubicación en el patio del castillo Sforzesco. Sin embargo, en diciembre de 1499, la familia Sforza fue expulsada de Milán por las tropas francesas. Leonardo dejó la estatua inacabada (fue destruida por los arqueros franceses que la usaron como diana) y regresó a Florencia en 1500. De esta primera etapa milanesa también cabe citar algunos retratos femeninos como el de La dama del armiño (Museo Czartoryski, Cracovia).

Durante su estancia en Florencia, viajó un año a Roma. En 1502 entró al servicio de César Borgia, duque de Romaña, hijo del papa Alejandro VI. En su calidad de arquitecto e ingeniero mayor del duque, Leonardo supervisó las obras en las fortalezas de los territorios papales del centro de Italia. En 1503, ya en Florencia, fue miembro de la comisión de artistas encargados de decidir sobre el adecuado emplazamiento del David de Miguel Ángel (1501-1504, Academia, Florencia), y también ejerció de ingeniero en la guerra contra Pisa. Al final de este año comenzó a planificar la decoración para el gran salón del palazzo della Signoria con el tema de la Batalla de Anghiari, victoria florentina en la guerra contra Pisa. Realizó numerosos dibujos y completó un cartón en 1505, pero nunca llegó a realizar la pintura en la pared. El cartón se destruyó en el siglo XVII, conociéndose la composición a través de copias como la que realizó Petrus Paulus Rubens.

Durante su segundo periodo florentino, Leonardo pintó varios retratos, pero el único que se ha conservado es el de La Gioconda (1503-1506, Louvre, París), uno de los retratos más famosos de toda la historia de la pintura, también conocido como Mona Lisa, al identificarse a la modelo con la esposa de Francesco del Giocondo, aunque se han barajado varias hipótesis sobre su verdadera identidad. La Gioconda, la obra más famosa de Leonardo, sobresale tanto por sus innovaciones técnicas como por el misterio de su legendaria sonrisa. La obra es un ejemplo consumado de dos técnicas —el sfumato y el claroscuro— de las que Leonardo fue uno de los primeros grandes maestros. El sfumato consiste en eliminar los contornos nítidos y precisos de las líneas y diluir o difuminar éstos en una especie de neblina que produce el efecto de inmersión en la atmósfera. En el caso de La Gioconda el sfumato se hace evidente en las gasas del manto y en la sonrisa. El claroscuro es la técnica de modelar las formas a través del contraste de luces y sombras. En el retrato que nos ocupa las delicadas manos de la modelo reflejan esa modulación luminosa de luz y sombra, mientras que los contrastes cromáticos apenas los utiliza. Si algo merece destacarse de forma especial es la enigmática sonrisa de la retratada. Parece ser que Leonardo sentía una gran predilección por esta obra ya que la llevaba consigo en sus viajes.

En 1506 regresó a Milán al servicio del gobernador francés Carlos II Chaumont, mariscal de Amboise. Al año siguiente fue nombrado pintor de la corte de Luis XII de Francia, que residía por entonces en la ciudad italiana. Durante los seis años siguientes Leonardo repartió su tiempo entre Milán y Florencia, donde a menudo visitaba a sus hermanastros y hermanastras y cuidaba de su patrimonio. En Milán continuó sus proyectos de ingeniería y trabajó en el monumento ecuestre de Gian Giacomo Trivulzio, comandante de las fuerzas francesas en la ciudad. Aunque el proyecto no se llegó a finalizar, se conservan dibujos y estudios sobre el mismo. De esta misma época parece ser la segunda versión de la Virgen de las rocas y Santa Ana, la Virgen y el Niño (c. 1510, Louvre, París). Desde 1514 hasta 1516 vivió en Roma bajo el mecenazgo de Giuliano de Medici, hermano del papa León X. Se alojaba en el palacio del Belvedere en el Vaticano, y se ocupaba fundamentalmente de experimentos científicos y técnicos.

En 1516 se trasladó a Francia a la corte de Francisco I, donde pasó sus últimos años en el castillo de Cloux, cerca de Amboise, en el que murió el 2 de mayo de 1519.